DNAは、私たちの世界における見えない定数です。そのA、T、C、Gが地球上のすべての生命の基盤を形成するだけでなく、生物から放出されたDNAは周囲の環境に広がり、場合によっては私たちよりも長く存在し続けます。
生体材料としてのDNAは驚くほど安定しています。冷涼で乾燥した環境、たとえば鉱化した骨の中に収まった洞窟の深部などに保存されると、DNAは数十万年もの間安定して存在することができます1。そのため、古代の人類の遺骨からDNAが発見されることは驚きではなく、進化の歴史を研究するための過去への窓を提供しています。
古代DNAの可能性は、その情報伝達能力にあります。DNAに保存されたパターンは、古代人類の生活やその時代の人口動態、さらには現代人の起源についても教えてくれる可能性があります。しかし、風化したサンプルからこの情報を引き出すのは簡単な作業ではありません。それは技術的に困難であるだけでなく、DNAを抽出する過程でサンプル自体が破壊されるため、これらの貴重な遺物を傷つける、または完全に破壊するリスクがあります。そのため、古代DNAを扱う際には、わずかな効率低下でさえ取り返しのつかない損失を招く可能性があり、誤りの余地はほとんどありません。このような高いリスクを伴う作業では、研究者が最適なツールを利用できることが極めて重要です。
過去を覗き見るためのツール
1984年、カリフォルニア大学バークレー校の研究者たちは、分子クローニング技術を用いて、世界初の古代DNA配列を生成しました。それは、140年前に絶滅したクアッガ（Equus quagga）の保存された筋組織から抽出された、300bp未満のミトコンドリアDNAの短い2つの断片でした2. この研究は、馬類の進化史に興味深い洞察を与えただけでなく、時を経たDNAが過去について貴重な情報を提供できるという概念実証としての役割を果たし、新たな学問分野である古ゲノミクス（paleogenomics）の基盤を築きました。
分子クローニングは古ゲノミクスの最初の試みを可能にしましたが、より高度なシーケンシング技術が採用されるにつれて、すぐにその役割を終えました3,4。現在では、外科医がメスを手に取るように、古代DNAを研究する科学者たちは次世代シーケンシング（NGS）の前処理としてターゲットエンリッチメントパネルを使用し、古代サンプルから信頼性の高いデータを抽出しています。
従来の技術（分子クローニングやPCRなど）の限られた能力とは対照的に、NGSは大規模な並列シーケンシングと広範囲なカバレッジを可能にし、個体の全ゲノムを1回のランでシーケンスすることができます。NGS技術が古代DNA分析に初めて使用されたのは2006年で、28,000年前のマンモスから抽出された約13MbのDNAとネアンデルタール人から抽出された約1MbのDNAがシーケンスされました。このNGSによる大幅な情報量の増加は、古ゲノミクスの急速な発展を促進しました（図1参照）。
しかし、その多くの利点にもかかわらず、NGSは特に古ゲノミクス研究において非常に高額なプロセスになることがあります。通常、発掘された遺物に含まれるDNAのうち、古代DNAが占める割合。10%未満であり、残りの90%（場合によってはそれ以上）は、細菌や真菌、あるいは現代人から放出された外来DNAで構成されています 4。 このような無関係な汚染DNAを無差別にシーケンスすれば、膨大なリソースが浪費されることになります。ここで役立つのが、 ターゲットエンリッチNGS（以下、ターゲットNGSと呼ぶ）です。
古代ゲノミクスにおけるターゲットNGSパネル
ターゲットNGSを用いることで、研究対象の遺伝的断片にシーケンシングリソースを集中させることが可能になります。そのため、通常、特定のターゲット配列に相補的となるように設計されたビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを合成します。これらのプローブは、サンプルDNAとインキュベートすることで、相補的なターゲット配列に結合します。その後、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを加えて、プローブと結合している配列を捕捉します。残りのDNAは洗い流され、興味のある断片のみが残ります。
過剰なDNAを取り除くことで、研究者は特定のゲノムターゲットにシーケンシングリソースを集中させることができ、より深いシーケンシングカバレッジを得ることができます。これにより、少ないコストでより正確なシーケンシング結果が得られることがよくあります（ターゲットエンリッチメントの利点について詳しくは、弊社の読み物をご覧ください）。
古代DNA（aDNA）の研究におけるターゲットエンリッチメントの強力な可能性を理解するために、簡単な計算を考えてみましょう。現代人ゲノムの全ゲノムシーケンシングを標準的な30xカバレッジで行うには、約4億リードが必要です。しかし、古代DNAサンプルにはしばしば多数の非ヒトDNAのコンタミネーションがあります。また、存在する古代人DNAは劣化しているため、使用可能なデータを生成する配列は1%未満です。広範囲な非ターゲット戦略を使用して興味のある変異のカバレッジを達成するには、シーケンシングリードの総数を数十億に増やす必要があり、実験が非常に高コストで非現実的になります。エンリッチメントを使用すると、興味のある変異領域のみにターゲットを絞り、コンタミしているDNA配列の多くを除去することができます。その結果、サンプルごとにわずか2500万リードで、数十万の変異に関する有用な情報を抽出できます。
2015年以来、古代ゲノム学の分野では「1240k reagent」として知られる特定のターゲットエンリッチメントパネルが主に用いられてきました。これは、124万もの情報量の多い多型を含むDNA断片をキャプチャするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブのコレクションです。2022年10月時点で、このパネルは世界の古代人DNAデータの70%以上を生成するために使用されました5。
しかしながら、1240k reagentは広く使用されているツールである一方、エンリッチメント効果のばらつき、アリルキャプチャのバイアス、商業製品が存在しないためにターゲットプローブセットの合成コストが高いといった制限があります5。これらの制限により、分野内でのデータセットの比較が難しくなるだけでなく、古代DNAのゲノム全体研究を行うことができる研究室が限られています。この問題を軽減するために、主要な研究者たちは古代DNAターゲットエンリッチメントパネルの設計とアクセス性を改善するために取り組んでいます。
🧬 DNAの劣化の種類
DNAは時間とともにさまざまな方法で劣化します。以下はその一部です：
- 断片化: DNAの糖-リン酸骨格とプリン塩基の間の化学結合は、加水分解によって切断されやすくなります。この結果、DNA鎖に塩基のない部位（アバシック部位）が生じます。このアバシック部位がさらに進むと、DNA鎖の切断を引き起こします。このため、古代DNAを抽出すると、通常は短い断片が得られるのです。
- 脱アミノ化: DNAの自然な劣化のもう一つの形態として、シトシンがウラシル塩基に脱アミノ化される現象があります。この変化は重要で、ポリメラーゼが複製中に塩基置換を取り込む原因となり、CからTおよびGからAの置換が生じます。これらの変化はシーケンス解析を混乱させる可能性があります。
- 損傷: DNAにはさまざまな修飾が起こることがあり、クロスリンク（架橋）を引き起こす場合があります。この修飾は酵素が機能を果たすのを妨げ、DNA鎖の複製を阻害することがあります。
TwistがDNAの劣化に対応し、古代の過去を解明する研究をどのように支援しているかについては、以下のウェビナーをご覧ください： Twist技術を使用して古代DNA解析のために140万SNPターゲットを効率的に濃縮する方法
Twist Ancient DNA パネル
2021年、Twist Bioscienceは、1240k reagentでカバーされている124万の多型に加え、追加の関連コンテンツを濃縮する古代DNA（aDNA）向けの商業的に利用可能なターゲットエンリッチメントパネルを開発しました。ハーバード大学のNadin Rohland、Swapan Mallick、Matthew Mah、Robert Maier、Nick Patterson、David Reichらは、彼らが設計した最適化されたTwist Ancient DNA Panelを1240k reagntおよび他の商業パネルとそれぞれ比較する研究を行いました。その結果、Twistのパネルは断片長に対するバイアスが少なく、非常に均一なカバレッジを提供し、全体的なSNPカバレッジが1.2倍から1.4倍向上することが示されました。また、高品質なデータを提供できるため、ショットガンシーケンシングデータと統合的に解析することが可能であり、この分野で長年未解決の課題であった問題を克服しました。
Twist Ancient DNA パネルの高いパフォーマンスにより、ハーバード大学の研究室は1240k reagentの使用を中止し、より新しい最適化されたパネルに移行しました。Twist試薬はすでに10,000回以上使用されています。また、このパネルは商業的に利用可能であるため、ターゲットエンリッチメントプローブの合成にかかる経済的負担を軽減し、古代ゲノム学研究への幅広い参加を可能にしています。
参考文献
Allentoft, Morten E., et al. “The Half-Life of DNA in Bone: Measuring Decay Kinetics in 158 Dated Fossils.” Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, vol. 279, no. 1748, 10 Oct. 2012, pp. 4724–4733, https://doi.org/10.1098/rspb.2012.1745.
Higuchi, Russell, et al. “DNA Sequences from the Quagga, an Extinct Member of the Horse Family.” Nature, vol. 312, no. 5991, Nov. 1984, pp. 282–284, ui.adsabs.harvard.edu/abs/1984Natur.312..282H, https://doi.org/10.1038/312282a0.
Danielewski, Mikołaj, et al. “Methodological Changes in the Field of Paleogenetics.” Genes, vol. 14, no. 1, 16 Jan. 2023, p. 234, https://doi.org/10.3390/genes14010234.
Shapiro, B., and M. Hofreiter. “A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA.” Science, vol. 343, no. 6169, 23 Jan. 2014, pp. 1236573–1236573, science.sciencemag.org/content/343/6169/1236573.full, https://doi.org/10.1126/science.1236573.
Rohland, Nadin, et al. “Three Assays for In-Solution Enrichment of Ancient Human DNA at More than a Million SNPs.” Genome Research, vol. 32, no. 11-12, 1 Nov. 2022, pp. 2068–2078, https://doi.org/10.1101/gr.276728.122.
Liu, Yue-Chen, et al. “Ancient DNA Reveals Five Streams of Migration into Micronesia and Matrilocality in Early Pacific Seafarers.” Science, vol. 377, no. 6601, July 2022, pp. 72–79, https://doi.org/10.1126/science.abm6536.